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                  《眼科新進展》  2023年7期 530-535   出版日期:2023-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
                  姜黃素在抑制紫外線B誘導的人視網膜色素上皮細胞DNA氧化損傷和凋亡中的作用


                  年齡相關性黃斑變性(AMD)是一種累及黃斑區的不可逆性退行性病變,是老年人失明和中心視力逐漸喪失的主要原因之一[1]。視網膜色素上皮(RPE)細胞在光感受器的保護和功能維持方面發揮至關重要的作用,其變性損傷所導致的光感受器細胞退化與AMD的發生發展密切相關[2]。此外,AMD的病因較為復雜,包括遺傳、吸煙、飲酒和紫外線B(UVB)照射等[3-4]。研究顯示,UVB照射是AMD發病的一個重要致病因素[5],可以誘導RPE細胞發生氧化損傷、炎癥和細胞凋亡[4]。鑒于此,了解UVB誘導的視網膜光毒性機制、尋找能夠抵抗UVB所致的氧化損傷的治療藥物迫在眉睫。姜黃素是從姜黃根中提取的黃色酚類色素,具有清除活性氧和誘導抗氧化反應的作用[6]。近年來,姜黃素被廣泛應用于治療氧化損傷導致的年齡相關性眼部疾病[7-10]。然而,姜黃素能否抵抗UVB誘導的RPE細胞內的氧化損傷,目前仍然未知。因此,本研究擬通過UVB照射人視網膜色素上皮細胞株(ARPE-19)來構建體外氧化損傷模型,探討姜黃素應對RPE細胞氧化損傷時的作用機制,以期為AMD的機制研究和預防及治療提供新的思路。
                  1 材料與方法 
                  1.1 材料 
                  1.1.1 細胞來源
                  ARPE-19細胞購自美國模式培養物研究所(ATCC)。
                  1.1.2 主要試劑及儀器
                  DMEM培養基、2.5 g·L-1胰蛋白酶和青鏈霉素均購自美國Gibco公司;胎牛血清購自阿根廷Natocor公司;姜黃素購自德國Sigma Aldrich公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;兔抗人磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)單克隆抗體(ab81299,1∶250)、兔抗人B淋巴細胞瘤-2基因(BCL-2)單克隆抗體(ab182858,1∶1 000)、兔抗人BCL-2相關X蛋白(BAX)單克隆抗體(ab32503,1∶1 000)均購自英國Abcam公司;PBS、線粒體膜電位與細胞凋亡檢測試劑盒(C1071S)均購自中國Beyotime Biotechnology公司。恒溫細胞培養箱購自美國Thermo Scientific公司;酶標儀購自美國BioTek公司;Western blot采用的通用型基礎電泳儀購自美國Bio-Rad公司;正置熒光顯微鏡購自德國Leica公司;手持UVB檢測燈購自上海光豪分析儀器公司。
                  1.2 方法 
                  1.2.1 細胞培養及分組
                  將ARPE-19細胞培養于含體積分數10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的完全培養基中,置于37 ℃、體積分數5% CO2、95%濕度條件下的細胞培養箱中。將細胞隨機分為空白對照組、姜黃素組、二甲基亞砜(DMSO)組、UVB照射組、UVB+DMSO組和UVB+姜黃素組。其中,空白對照組:不做任何處理;姜黃素組:加入終濃度為15 μmol·L-1的姜黃素處理細胞;DMSO組:加入和姜黃素組相同濃度的DMSO,用來排除DMSO帶來的影響;UVB照射組:將細胞置于紫外燈下照射10 min,照射劑量為100 mJ·cm-2,照射后更換新鮮完全培養基繼續培養24 h;UVB+DMSO組: UVB照射10 min后,更換新鮮完全培養基后加入1 μL DMSO,繼續培養24 h;UVB+姜黃素組: UVB照射10 min后,更換新鮮完全培養基后加入1 μL姜黃素,使其終濃度為15 μmol·L-1[9],繼續培養24 h。
                  1.2.2 CCK-8檢測細胞毒性和活力
                  將細胞接種于96孔板,接種密度為每孔1×104個細胞。為了檢測姜黃素對細胞的毒性作用,根據實驗設計將細胞分為空白對照組、DMSO組和姜黃素組;為了檢測姜黃素對UVB誘導的ARPE-19細胞活力的影響,分為空白對照組、UVB照射組、UVB+DMSO組和UVB+姜黃素組,每組設置6個平行孔。隨后,根據實驗設計處理完細胞24 h后,棄培養基,每孔加入100 μL新鮮培養基和10 μL CCK-8試劑,避光置于培養箱孵育1~2 h。利用酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度。數據分析以相對于空白對照組的百分比表示。
                  1.2.3 免疫熒光檢測DNA氧化損傷標志物的表達
                  為了探討姜黃素在UVB誘導的DNA氧化損傷中的作用,我們采用免疫熒光技術檢測DNA氧化損傷標志物的熒光強度變化。首先,將細胞接種于預先放置細胞爬片的24孔板中,接種密度為每孔3×104個細胞。根據實驗設計對細胞進行分組處理同1.2.1,棄細胞培養基,用PBS清洗3次后加入40 g·L-1 多聚甲醛室溫固定1 h;隨后加入配置的封閉液,即體積分數3%牛血清封閉液(牛血清白蛋白∶TritonX-100∶PBS為3 g∶1 mL∶100 mL)室溫封閉2 h。封閉結束后,加入10 g·L-1牛血清白蛋白稀釋的一抗反應液(γH2A,1∶250),4 ℃孵育過夜。次日,加入PBS稀釋的熒光二抗(IgG,1∶250),室溫避光孵育2 h。加入PBS稀釋的Hoechst(1∶10 000),室溫避光孵育8 min。隨后,封片劑封片,利用熒光顯微鏡進行觀察拍攝。
                  1.2.4 Western blot檢測BAX和BCL-2蛋白的表達
                  從培養箱中取出細胞,加入適量蛋白裂解液,冰上裂解后將細胞刮下轉移至1.5 mL EP管中,離心后收集上清,采用BCA法測定蛋白濃度;隨后通過凝膠電泳層析法(80 V轉120 V)和濕性轉膜法(250 mA,2 h)將靶蛋白轉移至PVDF膜上,5 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜2 h,隨后加入相應的一抗反應液,置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日,使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(二抗)室溫孵育2 h后,在暗室內進行曝光顯影。本實驗以GAPDH作為內參,計算目的蛋白的相對表達量。
                  1.2.5 線粒體膜電位和細胞凋亡情況檢測
                  為了深入探討姜黃素在UVB誘導的ARPE-19細胞凋亡中的作用,我們通過紅、綠熒光探針分別檢測ARPE-19細胞線粒體膜電位和細胞凋亡情況。首先,按上述方式將細胞接種于24孔板。根據實驗設計對細胞進行分組,待細胞處理結束,棄培養基,PBS清洗3次,每次5 min。隨后,先加入188 μL異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鈣離子依賴的磷脂結核蛋白Annexin V(Annexin V-FITC)結合液和5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻;再加入2 μL 細胞通透性的X-rosamine衍生物(Mito-Tracker Red CMXRos)染色液和5 μL赫斯特(Hoechst 33342)染色液,混勻孵育。室溫避光孵育20~30 min后置于冰上。熒光顯微鏡下觀察,Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光,Annexin V-FITC為綠色熒光,Hoechst 33342為藍色熒光。
                  1.3 統計學方法
                  采用SPSS 23.0統計學軟件進行統計分析,采用Graphpad Prism 9.0軟件繪制圖表。數據以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準:α=0.05。
                  2 結果 
                  2.1 姜黃素對ARPE-19細胞的毒性檢測
                  與空白對照組相比,DMSO組DMSO處理24 h后的ARPE-19細胞活力無明顯改變(P>0.05)。與DMSO組相比,姜黃素組采用15 μmol·L-1姜黃素處理24 h后ARPE-19細胞活力輕度升高(P<0.05),表明15 μmol·L-1姜黃素對ARPE-19細胞無毒性作用,后續實驗采用該濃度處理細胞。
                  2.2 姜黃素可增加UVB照射后ARPE-19細胞的活力
                  CCK-8檢測結果顯示,與空白對照組(100.00%)相比,UVB照射組ARPE-19細胞活力(48.32%±4.29%)顯著降低(P<0.001)。UVB照射組和UVB+DMSO組(48.9%±4.26%)之間ARPE-19細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)。與UVB+DMSO組相比,UVB+姜黃素組ARPE-19細胞活力(73.93%±3.68%)升高(P<0.01)。提示姜黃素可減輕UVB誘導的ARPE-19細胞氧化損傷,增加細胞的活力。
                  2.3 姜黃素對UVB誘導的ARPE-19細胞內DNA氧化損傷的影響
                  免疫熒光(圖1)和Western blot(圖2)檢測結果一致。與空白對照組(1.00±0.00)相比,UVB照射組γH2AX蛋白表達水平(2.67±0.08)升高(P<0.05)。UVB+DMSO組(2.69±0.05)和UVB照射組之間γH2AX蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與UVB+DMSO組相比,UVB+姜黃素組γH2AX蛋白表達水平(1.24±0.06)顯著降低(P<0.000 1)。提示姜黃素可減輕UVB誘導的ARPE-19細胞DNA損傷程度。





                  2.4 姜黃素可減少UVB誘導的ARPE-19細胞凋亡
                  Western blot檢測結果顯示,與空白對照組相比,UVB照射組促凋亡蛋白BAX表達水平明顯升高,而抑制凋亡的蛋白BCL-2表達水平則顯著降低(均為P<0.01)。UVB照射組與UVB+DMSO組BAX蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05),說明DMSO并不干擾UVB誘導的細胞凋亡。當加入姜黃素處理后,與UVB+DMSO組相比,UVB+姜黃素組BAX蛋白表達水平降低,BCL-2蛋白表達水平升高(均為P<0.05)。提示姜黃素可減少UVB誘導的ARPE-19細胞凋亡(圖3)。



                  2.5 姜黃素抑制UVB誘導的ARPE-19細胞的凋亡
                  與空白對照組相比,UVB照射組線粒體膜電位降低,ARPE-19細胞凋亡增多(均為P<0.05)。UVB照射組和UVB+DMSO組之間線粒體膜電位和ARPE-19細胞凋亡差異均無統計學意義(均為P>0.05)。當加入姜黃素處理后,與UVB+DMSO組相比,UVB+姜黃素組線粒體膜電位升高,ARPE-19細胞凋亡減少(均為P<0.05)(圖4)。說明DMSO既不影響UVB照射后ARPE-19細胞線粒體膜電位,也不干擾其細胞凋亡。


                  3 討論
                  紫外線照射引起的氧化損傷與AMD的形成密切相關。RPE細胞不僅參與液體和溶質通過血-視網膜屏障的運輸,還可防止血漿成分和有毒分子進入視網膜,并通過吞噬作用更新感光細胞[11]。目前已有研究證實,UVB照射可通過增加活性氧(ROS)含量以及調控內源性抗氧化物來誘導RPE細胞的DNA損傷和氧化應激[4]。此外,體內研究表明,UVB照射不僅在分子水平上可引起基因和蛋白質表達的失衡,而且在形態學上可導致視網膜色素脫失和玻璃膜疣形成[12]。盡管大多數學者對到達RPE層的UVB劑量仍存在爭議,但從長遠來看,即使是微小劑量的UVB照射也能對RPE細胞造成毒性作用。Patton等[13]采用90 mJ·cm-2的UVB對牛RPE細胞進行照射,結果顯示,經UVB照射的RPE細胞內存在DNA損傷,而未經UVB照射的細胞內DNA的結構仍呈現緊密排列。本研究結果顯示, UVB照射后ARPE-19細胞活力降低,DNA氧化損傷標志物γH2AX蛋白表達水平升高,進一步證實UVB可參與誘導RPE細胞發生DNA氧化損傷。以上研究結果均提示,UVB照射是AMD發病最為重要的環境因素之一。因此,尋找靶向UVB誘導的RPE細胞DNA氧化損傷的治療藥物至關重要。
                  姜黃素是一種從姜黃科植物根莖中提取的含有酚和醌基團的天然抗氧化化合物[14]。研究表明,姜黃素可以清除各種形式的自由基,如ROS等,并可抑制環氧化酶、單胺氧化酶等促進ROS生成的一系列酶。此外,姜黃素還可以參與調控谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的表達和活性變化[15-16]。Deng等[17]研究發現,姜黃素可通過激活Nrf2通路來保護人角質形成細胞免受UVB誘導的氧化損傷。Lin等[18]通過構建H2O2誘導的小梁網(TM)細胞氧化損傷模型發現,姜黃素可劑量依賴性地降低TM細胞內的ROS含量,并可減少由氧化應激介導的促炎因子IL-1α、IL-6蛋白等的釋放,繼而抑制TM細胞的凋亡。目前,也有少量的研究報道有關姜黃素對RPE細胞的影響。Bucolo等[9]研究發現,姜黃素可通過激活ERK1/2介導的Nrf2/HO-1通路來保護RPE細胞免受高糖誘導的氧化損傷,對糖尿病視網膜病變有潛在的治療價值。Zhou等[19]研究發現,姜黃素可通過激活p53下游通路抑制RPE細胞增生和上皮間質轉化,提示姜黃素可能對增生性玻璃體視網膜病變具有一定的治療作用。本研究結果顯示,姜黃素在UVB照射誘導的氧化環境下可提高RPE細胞活力,減輕RPE細胞DNA氧化損傷程度,并且通過增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達和抑制促凋亡蛋白BAX的表達來抑制RPE細胞凋亡。當然,本研究也存在一定的局限性,探索僅限于細胞機制層面,姜黃素具體通過何種機制來發揮其在AMD中的潛在治療價值還需要進一步的研究。
                  線粒體膜電位的降低是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件[20]。目前,越來越多的研究已證實姜黃素可在不同疾病中減輕線粒體功能障礙。Sabet等[21]研究發現,姜黃素可明顯改善貝伐單抗誘導的心肌細胞線粒體腫脹、線粒體膜電位降低等線粒體毒性,從而保護心肌細胞預防心力衰竭的發生。Wang等[22]研究發現,姜黃素可通過促進三磷酸腺苷的產生、抑制ROS的堆積和線粒體膜電位的降低來減緩由缺氧/復氧誘導的骨髓間充質細胞線粒體功能障礙。本研究中,UVB照射后ARPE-19細胞線粒體膜電位降低,細胞凋亡增加;而加入姜黃素處理后,線粒體膜電位升高,細胞凋亡減少,提示姜黃素對UVB誘導的ARPE-19細胞具有一定的保護作用。此外,鑒于線粒體膜電位的損耗比核酸酶的激活、磷脂酰絲氨酸暴露于細胞表面等細胞凋亡跡象出現的時間要早,因此,盡早抑制線粒體膜電位的降低可在早期阻止細胞凋亡的發生,這也將是后續實驗值得深入探討的部分。
                  4 結論
                  綜上所述,姜黃素能抑制UVB誘導的ARPE-19細胞DNA氧化損傷和凋亡,為AMD的預防和治療提供了新的思路和策略。
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