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                  《眼科新進展》  2023年7期 526-529   出版日期:2023-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
                  齊墩果酸對糖尿病大鼠視網膜氧化應激反應和視網膜神經節細胞損傷的影響


                  糖尿病視網膜病變是糖尿病患者典型的微血管并發癥之一。2020年,全球約有1.031億人患有糖尿病視網膜病變,預計到2045年將增加至1.605億人[1]。糖尿病視網膜病變現已成為全世界工作年齡人群致盲的首要原因[2]。在長期高血糖狀態下,視網膜代謝增加會引起缺血缺氧,加重氧化應激和視網膜神經節細胞(RGC)損傷[3],引起視功能下降[4]。因此,抗氧化應激是延緩糖尿病視網膜病變發展的重要方式之一。
                  核因子紅細胞2相關因子2(Nrf2)是一種細胞內轉錄因子,它通過與抗氧化反應元件結合來調控包括血紅素加氧酶1(HO-1)在內的多種抗氧化因子的基因表達,激活抗氧化保護系統,減輕氧化應激對細胞和組織的影響[5]。齊墩果酸是一種五環三萜類化合物,以游離和(或)與糖結合成苷的形式廣泛存在于植物界,具有保肝、抗糖尿病、抗炎、抗癌等多種藥理作用[6-7]。研究表明,齊墩果酸可以增加糖尿病大鼠心肌組織中Nrf2及HO-1蛋白的表達,減輕心肌組織的氧化應激,從而減輕糖尿病大鼠心肌的損傷[8]。本研究探討齊墩果酸對糖尿病大鼠視網膜氧化應激反應和RGC損傷的影響,為臨床防治糖尿病視網膜病變提供理論依據。
                  1 材料與方法 
                  1.1 材料 
                  1.1.1 實驗動物及分組
                  取6周齡健康清潔級雄性SD大鼠30只,體重180~220 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0009]。適應性喂養1周后,將30只大鼠隨機分為對照組、糖尿病組和齊墩果酸組,每組10只。本研究經河北省人民醫院醫學倫理委員會審核批準,實驗動物的喂養、使用和管理遵循《實驗動物管理條例》的規定。
                  1.1.2 試劑與儀器
                  鼠維持飼料與45%脂肪供能高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司),鏈脲佐菌素、齊墩果酸(美國Sigma公司),吐溫80和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),丙二醛(MDA)測定試劑盒與超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),腦特異性同源盒蛋白3a(Brn-3a)抗體(英國Abcam公司),Nrf2抗體和HO-1抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),石蠟切片機、倒置顯微鏡(德國LEICA公司)。
                  1.2 方法 
                  1.2.1 動物模型的建立
                  對照組大鼠給予鼠維持飼料喂養,糖尿病組和齊墩果酸組給予高脂飼料喂養。4周后,大鼠禁食12 h,取適量鏈脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中,按照35 mg·kg-1的劑量給予糖尿病組和齊墩果酸組大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素,對照組注射相應體積的檸檬酸鈉緩沖液。次日尾靜脈采血,如大鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1說明造模成功。剔除2只造模失敗的大鼠,最終對照組10只大鼠,糖尿病組9只,齊墩果酸組9只。
                  1.2.2 藥物干預及取材處理
                  將齊墩果酸溶于吐溫80,齊墩果酸組大鼠按照100 mg·kg-1劑量每天給予齊墩果酸灌胃;對照組及糖尿病組大鼠每天給予等量的溶劑灌胃。灌胃8周后,腹腔內注射100 g·L-1水合氯醛,過量麻醉處死各組大鼠,迅速摘取雙側眼球。于顯微鏡下迅速分離左眼視網膜,按1∶9的比例加入磷酸鹽緩沖液(PBS),充分研磨制成視網膜勻漿,4 ℃低溫離心機3 500 r·min-1離心10 min,取上清液放入-80 ℃保存,用于SOD活性和MDA含量檢測,取大鼠右側眼球迅速放入眼球固定液中,常規石蠟包埋后切片,厚度5 μm,用于HE染色及免疫組織化學染色。
                  1.2.3 視網膜組織中SOD活性和MDA含量檢測
                  取保存于-80 ℃的視網膜勻漿上清液,嚴格按照SOD、MDA試劑盒的說明書來測定視網膜組織中的SOD活性和MDA含量。
                  1.2.4 HE染色觀察大鼠視網膜組織形態
                  切片常規脫蠟至水,PBS洗3次,每次3 min;蘇木素染液浸染3 min,自來水沖洗;分化液分化15 s,自來水沖洗返藍;伊紅染液浸染2 min,自來水沖洗;梯度酒精脫水后二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察各組大鼠視網膜組織形態結構變化。
                  1.2.5 免疫組織化學染色
                  切片常規脫蠟至水,高壓抗原修復;滴加內源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育15 min,PBS洗3次,每次3 min;分別滴加一抗Brn3a(1∶200)、Nrf2(1∶400)、HO-1(1∶400),4 ℃孵育過夜,PBS洗3次,每次3 min;滴加二抗,室溫孵育1 h,PBS洗3次,每次3 min;DAB顯色,蘇木素染液復染1 min,自來水沖洗;分化液分化15 s,自來水沖洗返藍;梯度酒精脫水后二甲苯透明,中性樹膠封片后拍照;采用ImageJ軟件計算Brn3a染色陽性的RGC密度,測定單位面積內Nrf2及HO-1染色陽性平均光密度(MOD)。
                  1.3 統計學方法
                  本研究數據應用SPSS 21.0統計學軟件進行分析,數據以均數±標準差表示,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行組間比較,檢驗水準:α=0.05。
                  2 結果 
                  2.1 各組大鼠視網膜組織SOD活性及MDA含量
                  三組大鼠視網膜組織SOD活性比較,差異有統計學意義(P<0.05)。糖尿病組大鼠視網膜組織SOD活性低于對照組,齊墩果酸組大鼠視網膜組織SOD活性高于糖尿病組,差異均有統計學意義(均為P<0.05)。三組大鼠視網膜組織MDA含量比較,差異有統計學意義(P<0.05)。糖尿病組大鼠視網膜組織MDA含量高于對照組,齊墩果酸組大鼠視網膜組織MDA含量低于糖尿病組,差異均有統計學意義(均為P<0.05)(表1)。



                  2.2 各組大鼠視網膜組織形態變化 對照組大鼠視網膜RGC層、內叢狀層、內核層、外叢狀層和外核層各層結構清晰,細胞排列整齊、形態正常;與對照組相比,糖尿病組大鼠視網膜變薄,結構疏松,內核層和外核層細胞排列紊亂,外叢狀層連續性差;與糖尿病組相比,齊墩果酸組大鼠視網膜結構較清晰,細胞排列較整齊(圖1)。



                  2.3 各組大鼠視網膜組織RGC密度
                  三組大鼠視網膜組織RGC密度比較,差異有統計學意義(P<0.05)。 糖尿病組大鼠視網膜組織RGC密度小于對照組,齊墩果酸組大鼠視網膜組織RGC密度大于糖尿病組,差異均有統計學意義(均為P<0.05)(表1和圖2)。



                  2.4 各組大鼠視網膜組織Nrf2和HO-1蛋白表達
                  各組大鼠視網膜組織各層均有Nrf2、HO-1表達。三組大鼠視網膜組織Nrf2、HO-1染色陽性MOD比較,差異均有統計學意義(均為P<0.05)。糖尿病組大鼠視網膜組織Nrf2、HO-1染色陽性MOD均高于對照組,齊墩果酸組Nrf2、HO-1染色陽性MOD均高于糖尿病組,差異均有統計學意義(均為P<0.05)(表2)。



                  3 討論
                  糖尿病視網膜病變是糖尿病常見并發癥之一,也是導致患者視力受損和失明的主要原因[9]。糖尿病視網膜病變的發病機制目前尚未完全明確。研究表明,糖尿病視網膜病變的發生與氧化應激、炎癥、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活以及己糖胺途徑活化等多種機制相關[10]。其中,氧化應激是由于體內活性氧的產生和清除不平衡而引起的一種狀態,已被證實是糖尿病視網膜病變發病的關鍵因素之一[11]。RGC是一種特殊的投射神經元,位于視網膜內表面附近。研究表明,在糖尿病視網膜病變早期未出現明顯血管損傷時,就已出現RGC受損[12],其損傷、變性及凋亡可直接導致視功能的損害[13],減輕氧化應激所致RGC損傷是糖尿病視網膜病變防治的重要靶點。
                  Nrf2是一種調節氧化應激的重要轉錄因子,可誘導多種抗氧化基因的表達。在生理狀態下,Nrf2與Kelch樣ECH關聯蛋白1在細胞質中共價結合,當體內氧化應激增強時,關聯蛋白1發生構象變化,從而使Nrf2解離并轉入核內。在細胞核中,Nrf2與抗氧化反應元件結合,調控其下游抗氧化酶的轉錄,包括HO-1、醌氧化還原酶1等[14]。HO-1是血紅素降解的關鍵酶,可將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵,共同發揮抗氧化應激、抗炎等作用[15]。齊墩果酸是一種植物界廣泛存在的五環三萜類化合物,可以從多種植物及草藥中提取出來。它可以通過抑制小腸黏膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶活性,延緩碳水化合物吸收,降低餐后高血糖,從而發揮抗糖尿病的作用[16]。有文獻報道,齊墩果酸能夠激活Nrf2,上調細胞保護基因表達,抑制氧化應激反應[17]。
                  在本研究中,糖尿病組大鼠視網膜變薄、視網膜各層細胞排列紊亂、RGC密度減少,提示造模成功。SOD活性與MDA含量是常見的氧化應激指標。糖尿病組大鼠視網膜組織中SOD活性降低、MDA含量增加,氧化應激增強,RGC密度減少。同時機體的抗氧化應激機制啟動,表現為視網膜Nrf2、HO-1蛋白表達升高,這可能是糖尿病狀態下機體的適應性反應。而與糖尿病組相比,齊墩果酸組大鼠視網膜組織中SOD活性升高、MDA含量下降,說明經齊墩果酸治療后機體的抗氧化能力增強。同時大鼠視網膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達明顯升高、RGC密度增加,提示齊墩果酸能夠激活Nrf2,上調抗氧化因子HO-1的表達,從而減輕氧化應激損傷,保護受損的RGC。
                  4 結論 
                  齊墩果酸可能通過調控Nrf2/HO-1通路來減輕糖尿病大鼠視網膜氧化應激反應和RGC損傷。但是由于糖尿病的發病機制復雜,本研究仍存在一些不足,如未能在分子層面深入探究齊墩果酸的抗氧化應激作用,今后我們將進一步深入研究。
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